Photoluminescence spectroscopy

Photoluminescence is divided into two categories: fluorescence and phosphorescence. A

pair of electrons occupying the same electronic ground state have opposite spins and are
said to be in a singlet spin state (Figure 10.47a). When an analyte absorbs an ultraviolet
or visible photon, one of its valence electrons moves from the ground state to an excited
state with a conservation of the electron’s spin (Figure 10.47b). Emission of a photon
from the singlet excited state to the singlet ground state—or between any two energy
levels with the same spin—is called fluorescence. The probability of fluorescence is very
high and the average lifetime of an electron in the excited state is only 10 –5–10–8 s.
Fluorescence, therefore, decays rapidly once the source of excitation is removed.
In some cases an electron in a singlet excited state is transformed to a triplet excited
state (Figure 10.47c) in which its spin is no longer paired with the ground state. Emission
between a triplet excited state and a singlet ground state—or between any two energy
levels that differ in their respective spin states–is called phosphorescence. Because the
average lifetime for phosphorescence ranges from 10–4–104 s, phosphorescence may
continue for some time after removing the excitation source.

Figure 10.47 Electron configurations for (a) a singlet ground state; (b) a singlet
excited state; and (c) a triplet excited state.
The use of molecular fluorescence for qualitative analysis and semi-quantitative analysis
can be traced to the early to mid 1800s, with more accurate quantitative methods
appearing in the 1920s. Instrumentation for fluorescence spectroscopy using a filter or a
monochromator for wavelength selection appeared in, respectively, the 1930s and 1950s.
Although the discovery of phosphorescence preceded that of fluorescence by almost 200
years, qualitative and quantitative applications of molecular phosphorescence did not
receive much attention until after the development of fluorescence instrumentation.

10.6.1 Fluorescence and Phosphorescence

Spectra
To appreciate the origin of fluorescence and phosphorescence we must consider what
happens to a molecule following the absorption of a photon. Let’s assume that the
molecule initially occupies the lowest vibrational energy level of its electronic ground
state, which is a singlet state labeled S0 in Figure 10.48. Absorption of a photon excites
the molecule to one of several vibrational energy levels in the first excited electronic state,
S1, or the second electronic excited state, S2, both of which are singlet states. Relaxation
to the ground state occurs by a number of mechanisms, some involving the emission of
photons and others occurring without emitting photons. These relaxation mechanisms
are shown in Figure 10.48. The most likely relaxation pathway is the one with the shortest
lifetime for the excited state.

Figure 10.48 Energy level diagram for a molecule showing pathways for the
deactivation of an excited state: vr is vibrational relaxation; ic is internal
conversion; ec is external conversion; and isc is an intersystem crossing. The lowest
vibrational energy for each electronic state is indicated by the thicker line. The
electronic ground state is shown in black and the three electronic excited states are
shown in green. The absorption, fluorescence, and phosphorescence of photons also
are shown.
Radiationless Deactivation
When a molecule relaxes without emitting a photon we call the process radiationless
deactivation. One example of radiationless deactivation is vibrational relaxation, in
which a molecule in an excited vibrational energy level loses energy by moving to a lower
vibrational energy level in the same electronic state. Vibrational relaxation is very rapid,
with an average lifetime of <10–12 s. Because vibrational relaxation is so efficient, a
molecule in one of its excited state’s higher vibrational energy levels quickly returns to
the excited state’s lowest vibrational energy level.
Another form of radiationless deactivation is an internal conversion in which a
molecule in the ground vibrational level of an excited state passes directly into a higher
vibrational energy level of a lower energy electronic state of the same spin state. By a
combination of internal conversions and vibrational relaxations, a molecule in an excited
electronic state may return to the ground electronic state without emitting a photon. A
related form of radiationless deactivation is an external conversion in which excess
energy is transferred to the solvent or to another component of the sample’s matrix.
A final form of radiationless deactivation is an intersystem crossing in which a
molecule in the ground vibrational energy level of an excited electronic state passes into
a higher vibrational energy level of a lower energy electronic state with a different spin
state. For example, an intersystem crossing is shown in Figure 10.48 between a singlet
excited state, S1, and a triplet excited state, T1.

Note
Let’s use Figure 10.48 to illustrate how a molecule can relax back to its ground state
without emitting a photon. Suppose our molecule is in the highest vibrational energy level
of the second electronic excited state. After a series of vibrational relaxations brings the
molecule to the lowest vibrational energy level of S2, it undergoes an internal conversion
into a higher vibrational energy level of the first excited electronic state. Vibrational
relaxations bring the molecule to the lowest vibrational energy level of S 1. Following an
internal conversion into a higher vibrational energy level of the ground state, the molecule
continues to undergo vibrational relaxation until it reaches the lowest vibrational energy
level of S0.
Relaxation by Fluorescence
Fluorescence occurs when a molecule in an excited state’s lowest vibrational energy level
returns to a lower energy electronic state by emitting a photon. Because molecules return
to their ground state by the fastest mechanism, fluorescence is observed only if it is a
more efficient means of relaxation than a combination of internal conversions and
vibrational relaxations.
A quantitative expression of fluorescence efficiency is the fluorescent quantum yield,
Φf, which is the fraction of excited state molecules returning to the ground state by
fluorescence. Fluorescent quantum yields range from 1, when every molecule in an
excited state undergoes fluorescence, to 0 when fluorescence does not occur.
The intensity of fluorescence, If, is proportional to the amount of radiation absorbed by
the sample, P0 – PT, and the fluorescent quantum yield
If=kΦf(P0−PT)(10.25)(10.25)If=kΦf(P0−PT)
where k is a constant accounting for the efficiency of collecting and detecting the
fluorescent emission. From Beer’s law we know that
PTP0=10−εbC(10.26)(10.26)PTP0=10−εbC
where C is the concentration of the fluorescing species. Solving equation 10.26 for PT and
substituting into equation 10.25 gives, after simplifying
 If=kΦfP0(1−10−εbC)(10.27)(10.27)If=kΦfP0(1−10−εbC)
When εbC< 0.01, which often is the case when concentration is small, equation 10.27
simplifies to
If=2.303kΦfεbCP0=k'P0(10.28)(10.28)If=2.303kΦfεbCP0=k′P0
where k′ is a collection of constants. The intensity of fluorescent emission, therefore,
increases with an increase in the quantum efficiency, the source•fs incident power, and
the molar absorptivity and the concentration of the fluorescing species.
Fluorescence is generally observed when the molecule’s lowest energy absorption is a π
→ π* transition, although some n → π* transitions show weak fluorescence. Most
unsubstituted, nonheterocyclic aromatic compounds have favorable fluorescence
quantum yields, although substitutions on the aromatic ring can significantly effect Φ f.
For example, the presence of an electron-withdrawing group, such as –NO2, decreases
Φf, while adding an electron-donating group, such as –OH, increases Φf. Fluorescence
also increases for aromatic ring systems and for aromatic molecules with rigid planar
structures. Figure 10.49 shows the fluorescence of quinine under a UV lamp
Figure 10.49 Tonic water, which contains quinine, is fluorescent when placed under a
UV lamp. Source: Splarka (commons.wikipedia.org).
A molecule’s fluorescent quantum yield is also influenced by external variables, such as
temperature and solvent. Increasing the temperature generally decreases Φ f because
more frequent collisions between the molecule and the solvent increases external
conversion. A decrease in the solvent’s viscosity decreases Φf for similar reasons. For an
analyte with acidic or basic functional groups, a change in pH may change the analyte’s
structure and its fluorescent properties.
As shown in Figure 10.48, fluorescence may return the molecule to any of several
vibrational energy levels in the ground electronic state. Fluorescence, therefore, occurs
over a range of wavelengths. Because the change in energy for fluorescent emission is
generally less than that for absorption, a molecule’s fluorescence spectrum is shifted to
higher wavelengths than its absorption spectrum.
Relaxation by Phosphorescence
A molecule in a triplet electronic excited state’s lowest vibrational energy level normally
relaxes to the ground state by an intersystem crossing to a singlet state or by an external
conversion. Phosphorescence occurs when the molecule relaxes by emitting a photon. As
shown in Figure 10.48, phosphorescence occurs over a range of wavelengths, all of which
are at lower energies than the molecule’s absorption band. The intensity of
phosphorescence, Ip, is given by an equation similar to equation 10.28 for fluorescence
Ip=2.303kΦpεbCP0=k'P0(10.29)(10.29)Ip=2.303kΦpεbCP0=k′P0
where Φp is the phosphorescent quantum yield.
Phosphorescence is most favorable for molecules with n → π* transitions, which have a
higher probability for an intersystem crossing than π → π* transitions. For example,
phosphorescence is observed with aromatic molecules containing carbonyl groups or
heteroatoms. Aromatic compounds containing halide atoms also have a higher efficiency
for phosphorescence. In general, an increase in phosphorescence corresponds to a
decrease in fluorescence.
Because the average lifetime for phosphorescence is very long, ranging from 10–4–104 s,
the phosphorescent quantum yield is usually quite small. An improvement in Φp is realized
by decreasing the efficiency of external conversion. This may be accomplished in several
ways, including lowering the temperature, using a more viscous solvent, depositing the
sample on a solid substrate, or trapping the molecule in solution. Figure 10.50 shows an
example of phosphorescence.

Figure 10.50 An europium doped strontium silicate-aluminum oxide powder under (a)
natural light, (b) a long-wave UV lamp, and (c) in total darkness. The photo taken in
total darkness shows the phosphorescent emission. Source: modified
from Splarka (commons.wikipedia.org).
Excitation versus Emission Spectra
Photoluminescence spectra are recorded by measuring the intensity of emitted radiation
as a function of either the excitation wavelength or the emission wavelength.
An excitation spectrum is obtained by monitoring emission at a fixed wavelength while
varying the excitation wavelength. When corrected for variations in the source’s intensity
and the detector’s response, a sample’s excitation spectrum is nearly identical to its
absorbance spectrum. The excitation spectrum provides a convenient means for selecting
the best excitation wavelength for a quantitative or qualitative analysis.
In an emission spectrum a fixed wavelength is used to excite the sample and the
intensity of emitted radiation is monitored as function of wavelength. Although a molecule
has only a single excitation spectrum, it has two emission spectra, one for fluorescence
and one for phosphorescence. Figure 10.51 shows the UV absorption spectrum and the
UV fluorescence emission spectrum for tyrosine.

Figure 10.51 Absorbance spectrum and fluorescence emission spectrum for tyrosine in
a pH 7, 0.1 M phosphate buffer. The emission spectrum uses an excitation wavelength
of 260 nm. Source: modified from Mark Somoza (commons.wikipedia.org).

10.6.2 Instrumentation
The basic instrumental needs for monitoring fluorescence and phosphorescence—a
source of radiation, a means of selecting a narrow band of radiation, and a detector—are
the same as those for absorption spectroscopy. The unique demands of both techniques,
however, require some modifications to the instrument designs seen earlier in Figure
10.25 (filter photometer), Figure 10.26 (single-beam spectrophotometer), Figure 10.27
(double-beam spectrophotometer), and Figure 10.28 (diode array spectrometer). The
most important difference is the detector cannot be placed directly across from the
source. Figure 10.52 shows why this is the case. If we place the detector along the
source’s axis it will receive both the transmitted source radiation, PT, and the
fluorescent, If, or phosphorescent, Ip, radiation. Instead, we rotate the director and place
it at 90o to the source.
 Figure 10.52 Schematic diagram showing the orientation of the source and the
detector when measuring fluorescence and phosphorescence. Contrast this to Figure
10.21, which shows the orientation for absorption spectroscopy.
Instruments for Measuring Fluorescence
Figure 10.53 shows the basic design of an instrument for measuring fluorescence, which
includes two wavelength selectors, one for selecting an excitation wavelength from the
source and one for selecting the emission wavelength from the sample. In
a fluorimeter the excitation and emission wavelengths are selected using absorption or
interference filters. The excitation source for a fluorimeter is usually a low-pressure Hg
vapor lamp that provides intense emission lines distributed throughout the ultraviolet and
visible region (254, 312, 365, 405, 436, 546, 577, 691, and 773 nm). When a
monochromator is used to select the excitation and emission wavelengths, the instrument
is called a spectrofluorimeter. With a monochromator the excitation source is usually
high-pressure Xe arc lamp, which has a continuous emission spectrum. Either
instrumental design is appropriate for quantitative work, although only a
spectrofluorimeter can be used to record an excitation or emission spectrum.
 Figure 10.53 Schematic diagram for measuring fluorescence showing the placement
of the wavelength selectors for excitation and emission. When a filter is used the
instrument is called a fluorimeter, and when a monochromator is used the instrument is
called a spectrofluorimeter.
The sample cells for molecular fluorescence are similar to those for molecular absorption.
Remote sensing with fiber optic probes also can be adapted for use with either a
fluorimeter or spectrofluorimeter. An analyte that is fluorescent can be monitored directly.
For analytes that are not fluorescent, a suitable fluorescent probe molecule can be
incorporated into the tip of the fiber optic probe. The analyte’s reaction with the probe
molecule leads to an increase or decrease in fluorescence.
Instruments for Measuring Phosphorescence
Instrumentation for molecular phosphorescence must discriminate between
phosphorescence and fluorescence. Because the lifetime for fluorescence is shorter than
that for phosphorescence, discrimination is easily achieved by incorporating a delay
between exciting the sample and measuring phosphorescent emission. Figure 10.54
shows how two out-of-phase choppers can be use to block emission from reaching the
detector when the sample is being excited, and to prevent source radiation from reaching
the sample while we are measuring the phosphorescent emission.

Figure 10.54 Schematic diagram showing how choppers are used to prevent
fluorescent emission from interfering with the measurement of phosphorescent
emission.
Because phosphorescence is such a slow process, we must prevent the excited state from
relaxing by external conversion. Traditionally, this has been accomplished by dissolving
the sample in a suitable organic solvent, usually a mixture of ethanol, isopentane, and
diethylether. The resulting solution is frozen at liquid-N2 temperatures, forming an
optically clear solid. The solid matrix minimizes external conversion due to collisions
between the analyte and the solvent. External conversion also is minimized by
immobilizing the sample on a solid substrate, making possible room temperature
measurements. One approach is to place a drop of the solution containing the analyte on
a small disc of filter paper. After drying the sample under a heat lamp, the sample is
placed in the spectrofluorimeter for analysis. Other solid surfaces that have been used
include silica gel, alumina, sodium acetate, and sucrose. This approach is particularly
useful for the analysis of thin layer chromatography plates.

10.6.3 Quantitative Applications

Molecular fluorescence and, to a lesser extent, phosphorescence have been used for the
direct or indirect quantitative analysis of analytes in a variety of matrices. A direct
quantitative analysis is possible when the analyte’s fluorescent or phosphorescent
quantum yield is favorable. When the analyte is not fluorescent or phosphorescent, or if
the quantum yield is unfavorable, then an indirect analysis may be feasible. One approach
is to react the analyte with a reagent to form a product with fluorescent or
phosphorescent properties. Another approach is to measure a decrease in fluorescence
or phosphorescence when the analyte is added to a solution containing a fluorescent or
phosphorescent probe molecule. A decrease in emission is observed when the reaction
between the analyte and the probe molecule enhances radiationless deactivation, or
produces a nonemittng product. The application of fluorescence and phosphorescence to
inorganic and organic analytes are considered in this section.
Inorganic Analytes
Except for a few metal ions, most notably UO2+, most inorganic ions are not sufficiently
fluorescent for a direct analysis. Many metal ions may be determined indirectly by reacting
with an organic ligand to form a fluorescent, or less commonly, a phosphorescent metal–
ligand complex. One example is the reaction of Al3+ with the sodium salt of 2, 4, 3′-
trihydroxyazobenzene-5′-sulfonic acid—also known as alizarin garnet R—which forms a
fluorescent metal–ligand complex (Figure 10.55). The analysis is carried out using an
excitation wavelength of 470 nm, monitoring fluorescence at 500 nm. Table 10.12
provides additional examples of chelating reagents that form fluorescent metal–ligand
complexes with metal ions. A few inorganic nonmetals are determined by their ability to
decrease, or quench, the fluorescence of another species. One example is the analysis
for F– based on its ability to quench the fluorescence of the Al3+–alizarin garnet R complex.
……

10.6.4 Evaluation of Photoluminescence

Spectroscopy
Scale of Operation
Photoluminescence spectroscopy is used for the routine analysis of trace and ultratrace
analytes in macro and meso samples. Detection limits for fluorescence spectroscopy are
strongly influenced by the analyte’s quantum yield. For an analyte with Φf > 0.5, a
picomolar detection limit is possible when using a high quality spectrofluorimeter. For
example, the detection limit for quinine sulfate, for which Φf is 0.55, is generally between
1 part per billion and 1 part per trillion. Detection limits for phosphorescence are
somewhat higher, with typical values in the nanomolar range for low-temperature
phosphorimetry, and in the micromolar range for room-temperature phosphorimetry
using a solid substrate.

Note
See Figure 3.5 to review the meaning of macro and meso for describing samples, and the
meaning of major, minor, and ultratrace for describing analytes.
Accuracy
The accuracy of a fluorescence method is generally between 1–5% when spectral and
chemical interferences are insignificant. Accuracy is limited by the same types of problems
affecting other optical spectroscopic methods. In addition, accuracy is affected by
interferences influencing the fluorescent quantum yield. The accuracy of
phosphorescence is somewhat greater than that for fluorescence.
Precision
The relative standard deviation for fluorescence is usually between 0.5–2% when the
analyte’s concentration is well above its detection limit. Precision is usually limited by the
stability of the excitation source. The precision for phosphorescence is often limited by
reproducibility in preparing samples for analysis, with relative standard deviations of 5–
10% being common.
Sensitivity
From equation 10.28 and equation 10.29 we know that the sensitivity of a fluorescent or
phosphorescent method is influenced by a number of parameters. The importance of
quantum yield and the effect of temperature and solution composition on Φ f and
Φp already have been considered. Besides quantum yield, the sensitivity of an analysis
can be improved by using an excitation source that has a greater emission intensity, P0,
at the desired wavelength, and by selecting an excitation wavelength that has a greater
absorbance. Another approach for improving sensitivity is to increase the volume in the
sample from which emission is monitored. Figure 10.56 shows how rotating a
monochromator’s slits from their usual vertical orientation to a horizontal orientation
increases the sampling volume. The result can increase the emission from the sample by
5–30×

Figure 10.56 Use of slit orientation to change the volume from which fluorescence is
measured: (a) vertical slit orientation; (b) horizontal slit orientation. Suppose the slit’s
dimensions are 0.1 mm × 3 mm. In (a) the dimensions of the sampling volume are 0.1
mm × 0.1mm × 3 mm, or 0.03 mm3. For (b) the dimensions of the sampling
volume are 0.1 mm × 3 mm × 3 mm, or 0.9 mm3, a 30-fold increase in the sampling
volume.
Selectivity
The selectivity of fluorescence and phosphorescence is superior to that of absorption
spectrophotometry for two reasons: first, not every compound that absorbs radiation is
fluorescent or phosphorescent; and, second, selectivity between an analyte and an
interferent is possible if there is a difference in either their excitation or their emission
spectra. The total emission intensity is a linear sum of that from each fluorescent or
phosphorescent species. The analysis of a sample containing n components, therefore,
can be accomplished by measuring the total emission intensity at n wavelengths.
Fotoluminescența este împărțită în două categorii: fluorescență și fosforescență. O pereche de electroni
care ocupă aceeași stare de bază electronică au rotiri opuse și se spune că se află într-o stare de rotire a
unității singulare (Figura 10.47a). Când un analit absoarbe un foton ultraviolet sau vizibil, unul dintre
electronii săi de valență se deplasează de la starea de la sol la o stare excitată cu o conservare a spinului
electronului (figura 10.47b). Emisiunea unui foton din starea excitată a singletului în starea de sol a
singletului - sau între oricare două niveluri de energie cu aceeași rotire - se numește fluorescență.
Probabilitatea de fluorescență este foarte mare, iar durata medie de viață a unui electron în stare
excitată este de numai 10–5–10–8 s. Prin urmare, fluorescența se descompune rapid odată cu
îndepărtarea sursei de excitație.

În unele cazuri, un electron într-o stare excitată individuală este transformat într-o stare excitată triplă
(figura 10.47c) în care spinul său nu mai este asociat cu starea de bază. Emisiunea între o stare excitată
triplă și o stare de sol singură - sau între cele două niveluri de energie care diferă în stările de rotire
respective - se numește fosforescență. Deoarece durata medie de viață pentru fosforescență este
cuprinsă între 10 și 4-104 s, fosforescența poate continua ceva timp după eliminarea sursei de excitație.

Figura 10.47 Configurații electronice pentru (a) o stare de sol a solului; (b) o stare excitată de singletă; și
(c) o stare triplă excitată.

Utilizarea fluorescenței moleculare pentru analiza calitativă și analiza semicantitativă poate fi urmărită la
începutul până la mijlocul anilor 1800, metode cantitative mai precise apar în anii 1920. Instrumentația
pentru spectroscopie fluorescentă folosind un filtru sau un monocromator pentru selectarea lungimii de
undă a apărut în anii 1930 și 1950. Deși descoperirea fosforescenței a precedat-o pe cea a fluorescenței
cu aproape 200 de ani, aplicațiile calitative și cantitative ale fosforescenței moleculare nu au primit
multă atenție decât după dezvoltarea instrumentării cu fluorescență.

10.6.1 Spectre de fluorescență și fosforescență

Pentru a aprecia originea fluorescenței și fosforescenței, trebuie să luăm în considerare ce se întâmplă

cu o moleculă în urma absorbției unui foton. Să presupunem că molecula ocupă inițial cel mai scăzut
nivel de energie vibrațională al stării sale de bază electronice, care este o stare de singletă etichetată S0
în figura 10.48. Absorbția unui foton excită molecula la unul dintre mai multe niveluri de energie
vibrațională în prima stare electronică excitată, S1 sau a doua stare excitată electronică, S2, ambele fiind
stări singulare. Relaxarea la starea de la sol se produce printr-o serie de mecanisme, unele care implică
emisia fotonilor și altele care se produc fără a emite fotoni. Aceste mecanisme de relaxare sunt
prezentate în figura 10.48. Cea mai probabilă cale de relaxare este cea cu cea mai scurtă durată de viață
pentru starea emoționată.

Figura 10.48 Diagrama nivelului energetic pentru o moleculă care prezintă căi de dezactivare a unei stări
excitate: vr este relaxare vibrațională; ic este conversie internă; ec este conversie externă; și isc este o
trecere intersistemică. Cea mai mică energie vibrațională pentru fiecare stare electronică este indicată
de linia mai groasă. Starea de bază electronică este afișată în negru și cele trei stări electronice excitate
sunt afișate în verde. De asemenea, sunt prezentate absorbția, fluorescența și fosforescența fotonilor.

Dezactivare fără radiații

Când o moleculă se relaxează fără să emită un foton, numim procesul dezactivare fără radiații. Un
exemplu de dezactivare fără radiații este relaxarea vibrațională, în care o moleculă aflată într-un nivel de
energie vibrațional excitat pierde energie prin trecerea la un nivel de energie vibrațională mai mic în
aceeași stare electronică. Relaxarea vibrațională este foarte rapidă, cu o durată de viață medie de <10-
12 sec. Deoarece relaxarea vibrațională este atât de eficientă, o moleculă din unul dintre nivelurile de
energie vibraționale mai mari ale stării sale excitate revine rapid la cel mai scăzut nivel de energie
vibrațională al statului excitat.

O altă formă de dezactivare fără radiații este o conversie internă în care o moleculă din nivelul
vibrațional de la sol al unei stări excitate trece direct într-un nivel de energie vibrațională mai ridicat al
unei stări electronice cu energie mai mică din aceeași stare de rotire. Printr-o combinație de conversii
interne și relaxări vibraționale, o moleculă într-o stare electronică excitată poate reveni la starea
electronică la sol fără a emite un foton. O formă conexă de dezactivare fără radiații este o conversie
externă în care excesul de energie este transferat către solvent sau către o altă componentă a matricei
eșantionului.

O formă finală de dezactivare fără radiații este o încrucișare intersistemă în care o moleculă din nivelul
de energie vibrațională la sol al unei stări electronice excitate trece într-un nivel energetic vibrațional
mai ridicat al unei stări electronice cu energie mai mică, cu o stare de spin diferită. De exemplu, o figura
de intersecție este prezentată în figura 10.48 între o stare excitată individuală, S1 și o stare excitată
triplă, T1.

Notă

Să folosim figura 10.48 pentru a ilustra modul în care o moleculă se poate relaxa la starea sa de bază
fără a emite un foton. Să presupunem că molecula noastră se află în cel mai înalt nivel de energie
vibrațională a celei de-a doua stări electronice excitate. După o serie de relaxări vibraționale aduce
molecula la cel mai scăzut nivel de energie vibrațională al S2, aceasta trece printr-o conversie internă
într-un nivel de energie vibrațională mai ridicat al primei stări electronice excitate. Relaxările
vibraționale aduc molecula la cel mai scăzut nivel de energie vibrațională S1. După o conversie internă
într-un nivel de energie vibrațională mai mare al stării solului, molecula continuă să se relaxeze
vibrațional până când atinge cel mai scăzut nivel de energie vibrațională de S0.

Relaxare prin fluorescență

Fluorescența apare atunci când o moleculă aflată în cel mai scăzut nivel de energie vibrațională al unei
stări excitate revine la o stare electronică cu energie mai mică, prin emiterea unui foton. Deoarece
moleculele revin la starea lor de bază prin mecanismul cel mai rapid, fluorescența este observată numai
dacă este un mijloc mai eficient de relaxare decât o combinație de conversii interne și relaxări
vibraționale.

O expresie cantitativă a eficienței fluorescenței este randamentul cuantic fluorescent, Φf, care este
fracția moleculelor de stare excitată care se întoarce la starea solului prin fluorescență. Randamentele
cuantice fluorescente variază de la 1, când fiecare moleculă într-o stare excitată suferă fluorescență,
până la 0 când nu apare fluorescență.

Intensitatea fluorescenței, Dacă, este proporțională cu cantitatea de radiație absorbită de eșantion, P0 -

PT și randamentul cuantic fluorescent…
Fluorescența este observată în general atunci când cea mai mică absorbție de energie a moleculei este o
tranziție π → π *, deși unele tranziții n → π * prezintă o fluorescență slabă. Majoritatea compușilor
aromatici neheterociclici nesubstituiți au randamente cuantice fluorescente favorabile, deși substituțiile
pe inelul aromatic pot avea efect semnificativ Φf. De exemplu, prezența unui grup care retrage
electroni, cum ar fi -NO2, scade Φf, în timp ce se adaugă un grup donator de electroni, cum ar fi -OH,
crește Φf. Fluorescența crește, de asemenea, pentru sistemele cu inele aromatice și pentru moleculele
aromatice cu structuri plane plane rigide. Figura 10.49 prezintă fluorescența chininei sub o lampă UV.

Figura 10.49 Apa tonică, care conține chinină, este fluorescentă atunci când este plasată sub o lampă
UV. Sursa: Splarka (commons.wikipedia.org).

Randamentul cuantic fluorescent al unei molecule este influențat și de variabile externe, cum ar fi
temperatura și solventul. Creșterea temperaturii scade în general Φf, deoarece coliziunile mai frecvente
între moleculă și solvent crește conversia externă. O scădere a vâscozității solventului scade Φf din
motive similare. Pentru un analit cu grupuri funcționale acide sau de bază, o modificare a pH-ului poate
modifica structura și proprietățile fluorescente ale analitului.

Așa cum se arată în figura 10.48, fluorescența poate returna molecula la oricare din mai multe niveluri
de energie vibrațională din starea electronică la sol. Prin urmare, fluorescența apare pe o gamă de
lungimi de undă. Deoarece schimbarea energiei pentru emisii fluorescente este, în general, mai mică
decât cea pentru absorbție, spectrul de fluorescență al unei molecule este mutat la lungimi de undă mai
mari decât spectrul de absorbție.

Relaxare prin fosforescență

O moleculă aflată într-o triplă nivel de energie vibrațională cel mai scăzut în stare emoțională se
relaxează în mod normal la starea solului printr-o trecere intersistemă la o stare de singletă sau printr-o
conversie externă. Fosforescența apare atunci când molecula se relaxează prin emiterea unui foton. Așa
cum se arată în figura 10.48, fosforescența apare pe o gamă de lungimi de undă, toate acestea fiind cu
energii mai mici decât banda de absorbție a moleculei. Intensitatea fosforescenței, Ip, este dată de o
ecuație similară cu ecuația 10.28 pentru fluorescență

Ip = 2.303kΦpεbCP0 = k'P0 (10,29)

unde Φp este randamentul cuant fosforescent.

Fosforescența este cea mai favorabilă pentru moleculele cu tranziții n → π *, care au o probabilitate mai
mare pentru o trecere intersistemă decât tranzițiile π → π *. De exemplu, fosforescența este observată
cu molecule aromatice care conțin grupe carbonil sau heteroatomi. Compușii aromatici care conțin
atomi de halogenă au, de asemenea, o eficiență mai mare pentru fosforescență. În general, o creștere a
fosforescenței corespunde unei scăderi a fluorescenței.

Deoarece durata medie de viață a fosforescenței este foarte lungă, cuprinsă între 10-10-104 s,
randamentul cuant fosforescent este de obicei destul de mic. O îmbunătățire a Φp se realizează prin
scăderea eficienței conversiei externe. Acest lucru poate fi realizat în mai multe moduri, inclusiv
scăderea temperaturii, folosind un solvent mai vâscos, depunerea eșantionului pe un substrat solid sau
capcarea moleculei în soluție. Figura 10.50 prezintă un exemplu de fosforescență.
Figura 10.50 O pulbere de oxid de aluminiu silicat de stronțiu dopat sub (a) lumină naturală, (b) o lampă
UV cu undă lungă și (c) în întuneric total. Fotografia realizată în întuneric total arată emisia
fosforescentă. Sursa: modificat din Splarka (commons.wikipedia.org).

Excitație versus spectre de emisie

Spectrele de fotoluminiscență sunt înregistrate prin măsurarea intensității radiației emise, în funcție de
lungimea de undă de excitație sau de lungimea de undă de emisie. Un spectru de excitație este obținut
prin monitorizarea emisiilor la o lungime de undă fixă, în timp ce variază lungimea de undă de excitație.
Când sunt corectate pentru variații în intensitatea sursei și răspunsul detectorului, spectrul de excitație
al unui eșantion este aproape identic cu spectrul său de absorbție. Spectrul de excitație oferă un mijloc
convenabil pentru selectarea celei mai bune lungimi de undă de excitație pentru o analiză cantitativă
sau calitativă.

Într-un spectru de emisie, o lungime de undă fixă este utilizată pentru a excita proba și intensitatea
radiației emise este monitorizată în funcție de lungimea de undă. Deși o moleculă are un singur spectru
de excitație, are două spectre de emisie, una pentru fluorescență și una pentru fosforescență. Figura
10.51 prezintă spectrul de absorbție UV și spectrul de emisie de fluorescență UV pentru tirozină.
Figura 10.51 Spectru de absorbție și spectru de emisie de fluorescență pentru tirozină într-un tampon
fosfat cu pH 7, 0,1 M. Spectrul de emisie utilizează o lungime de undă de excitație de 260 nm. Sursa:
modificat de la Mark Somoza (commons.wikipedia.org).

10.6.2 Instrumentare

Nevoile instrumentale de bază pentru monitorizarea fluorescenței și fosforescenței - o sursă de radiație,

un mijloc de selectare a unei benzi înguste de radiații și un detector - sunt aceleași cu cele pentru
spectroscopie de absorbție. Cerințele unice ale ambelor tehnici necesită totuși unele modificări ale
proiectelor instrumentelor văzute anterior în figura 10.25 (fotometru filtru), figura 10.26
(spectrofotometru cu fascicul unic), figura 10.27 (spectrofotometru cu fascicul dublu) și în figura 10.28
(tablou de diode) spectrometru). Cea mai importantă diferență este că detectorul nu poate fi amplasat
direct față de sursă. Figura 10.52 arată de ce este cazul. Dacă plasăm detectorul de-a lungul axei sursei,
acesta va primi atât radiații surse transmise, PT, cât și radiații fluorescente, If, sau fosforescente, Ip. În
schimb, rotim directorul și îl plasăm la 90o la sursă.
Figura 10.52 Schema care arată orientarea sursei și a detectorului atunci când se măsoară fluorescența
și fosforescența. Contrastați-o cu Figura 10.21, care arată orientarea pentru spectroscopie de absorbție.

Instrumente pentru măsurarea fluorescenței

Figura 10.53 prezintă designul de bază al unui instrument pentru măsurarea fluorescenței, care include
doi selectori de lungime de undă, unul pentru selectarea unei lungimi de undă de excitație de la sursă și
unul pentru selectarea lungimii de undă de emisie din eșantion. Într-un fluorimetru lungimile de undă de
excitație și emisie sunt selectate folosind filtre de absorbție sau interferențe. Sursa de excitație pentru
un fluorimetru este, de obicei, o lampă cu vapori de Hg cu presiune joasă, care oferă linii de emisie
intensă distribuite în întreaga regiune ultravioletă și vizibilă (254, 312, 365, 405, 436, 546, 577, 691 și
773 nm). Atunci când un monocromator este utilizat pentru a selecta lungimile de undă de excitație și de
emisie, instrumentul se numește spectrofluorimetru. Cu un monocromator, sursa de excitație este de
obicei o lampă cu arc de înaltă presiune Xe, care are un spectru de emisie continuă. Oricare proiectare
instrumentală este potrivită pentru lucrări cantitative, deși numai un spectrofluorimetru poate fi utilizat
pentru a înregistra un spectru de excitație sau de emisie.
Figura 10.53 Schema de măsurare a fluorescenței care arată plasarea selectoarelor de undă pentru
excitație și emisie. Când se folosește un filtru, instrumentul se numește fluorimetru, iar când se folosește
un monocromator, instrumentul se numește spectrofluorimetru.

Celulele de probă pentru fluorescență moleculară sunt similare cu cele pentru absorbție moleculară.
Teledetecția cu sonde de fibră optică poate fi, de asemenea, adaptată pentru utilizare fie cu un
fluorimetru, fie cu un spectrofluorimetru. Un analit fluorescent poate fi monitorizat direct. Pentru
analitele care nu sunt fluorescente, o moleculă sondă fluorescentă adecvată poate fi încorporată în
vârful sondei cu fibră optică. Reacția analitului cu molecula sondă conduce la o creștere sau o scădere a
fluorescenței.

Instrumente pentru măsurarea fosforescenței

Instrumentarea pentru fosforescență moleculară trebuie să discrimineze între fosforescență și
fluorescență. Deoarece durata de viață pentru fluorescență este mai scurtă decât cea pentru
fosforescență, discriminarea se realizează cu ușurință prin încorporarea unei întârzieri între
eșantionarea excitantă și măsurarea emisiilor fosforescente. Figura 10.54 arată cum pot fi utilizate două
butaie în afara fazei pentru a bloca emisia să ajungă la detector atunci când eșantionul este excitat și
pentru a preveni radiația sursă să ajungă la eșantion în timp ce măsurăm emisia fosforescentă.

Figura 10.54 Schema de schemă care arată modul în care se utilizează butacii pentru a împiedica emisia
fluorescentă să intervină cu măsurarea emisiilor fosforescente.

Deoarece fosforescența este un proces atât de lent, trebuie să prevenim relaxarea statului excitat prin
conversie externă. În mod tradițional, acest lucru s-a realizat prin dizolvarea probei într-un solvent
organic adecvat, de obicei un amestec de etanol, izopentan și dietileter. Soluția rezultată este înghețată
la temperaturi lichide-N2, formând un solid optic limpede. Matricea solidă minimizează conversia
externă datorită coliziunilor dintre analit și solvent. Conversia externă este, de asemenea, minimizată
prin imobilizarea probei pe un substrat solid, făcând posibile măsurători ale temperaturii camerei. O
abordare este de a plasa o picătură a soluției care conține analitul pe un disc mic de hârtie de filtru.
După uscarea eșantionului sub o lampă de căldură, eșantionul este plasat în spectrofluorimetru pentru
analiză. Alte suprafețe solide care au fost utilizate includ silicagel, alumină, acetat de sodiu și zaharoză.
Această abordare este deosebit de utilă pentru analiza plăcilor de cromatografie în strat subțire.

10.6.3 Aplicații cantitative

Fluorescența moleculară și, într-o măsură mai mică, fosforescența au fost utilizate pentru analiza
cantitativă directă sau indirectă a analitelor într-o varietate de matrice. O analiză cantitativă directă este
posibilă atunci când randamentul cuantului fluorescent sau fosforescent este favorabil. Când analitul nu
este fluorescent sau fosforescent sau dacă randamentul cuantic nu este favorabil, atunci o analiză
indirectă poate fi posibilă. O abordare este de a reacționa analitul cu un reactiv pentru a forma un
produs cu proprietăți fluorescente sau fosforescente. O altă abordare este măsurarea unei scăderi a
fluorescenței sau a fosforescenței atunci când analitele sunt adăugate la o soluție care conține o
moleculă sondă fluorescentă sau fosforescentă. O scădere a emisiilor este observată atunci când reacția
dintre analit și molecula sondă îmbunătățește dezactivarea fără radiații sau produce un produs fără
emisiune. Aplicarea fluorescenței și fosforescenței pe analitele anorganice și organice sunt luate în
considerare în această secțiune.

Analize anorganice

Cu excepția câtorva ioni metalici, în special UO2 +, majoritatea ionilor anorganici nu sunt suficient de
fluorescente pentru o analiză directă. Mulți ioni metalici pot fi determinați indirect, reacționând cu un
ligand organic pentru a forma un complex fluorescent sau mai puțin obișnuit, un fosforoscent metal-
ligand. Un exemplu este reacția Al3 + cu sare de sodiu a acidului 2, 4, 3′-trihidroxyazobenzen-5′-sulfonic -
cunoscută și sub numele de granat R alizarin - care formează un complex fluorescent metal-ligand (figura
10.55). Analiza este realizată folosind o lungime de undă de excitație de 470 nm, monitorizând
fluorescența la 500 nm. Tabelul 10.12 oferă exemple suplimentare de reactivi chelați care formează
complexe fluorescente de metal-ligand cu ioni metalici. Câteva nemetale anorganice sunt determinate
de capacitatea lor de a scădea sau de a potoli fluorescența altei specii. Un exemplu este analiza pentru F
- bazată pe capacitatea sa de a stinge fluorescența complexului Al3 + -alizarină granat R.

10.6.4 Evaluarea spectroscopiei fotoluminiscenței

Scala de funcționare

Spectroscopia fotoluminiscenței este utilizată pentru analiza de rutină a analitelor de urmă și ultratracție
în probe macro și mezo. Limitele de detecție pentru spectroscopia fluorescenței sunt puternic
influențate de randamentul cuantic al analitului. Pentru un analit cu Φf> 0,5, este posibilă o limită de
detectare picomolară atunci când se utilizează un spectrofluorimetru de înaltă calitate. De exemplu,
limita de detecție a sulfatului de chinină, pentru care Φf este 0,55, este în general între 1 parte per
miliard și 1 parte pe trilion. Limitele de detecție pentru fosforescență sunt ceva mai mari, cu valori tipice
în intervalul nanomolar pentru fosforimetrie la temperaturi scăzute, iar în gama micromolară pentru
fosforimetrie la temperatura camerei folosind un substrat solid.

Notă

Vezi Figura 3.5 pentru a trece în revistă sensul macro și meso pentru descrierea eșantioanelor și
semnificația majorului, minorului și ultratracei pentru descrierea analitelor.

Precizie

Precizia unei metode de fluorescență este în general între 1-5% atunci când interferențele spectrale și
chimice sunt nesemnificative. Precizia este limitată de aceleași tipuri de probleme care afectează alte
metode spectroscopice optice. În plus, precizia este afectată de interferențele care influențează
randamentul cuantic fluorescent. Precizia fosforescenței este ceva mai mare decât cea pentru
fluorescență.

Precizie

Abateria standard relativă pentru fluorescență este, de obicei, cuprinsă între 0,5 și 2% atunci când
concentrația analitului este mult peste limita de detecție. Precizia este de obicei limitată de stabilitatea
sursei de excitație. Precizia fosforescenței este adesea limitată de reproductibilitatea în pregătirea
eșantioanelor pentru analiză, deviațiile standard relative de 5-10% fiind frecvente.

Sensibilitate

Din ecuația 10.28 și ecuația 10.29 știm că sensibilitatea unei metode fluorescente sau fosforescente este
influențată de o serie de parametri. Importanța randamentului cuantic și efectul compoziției
temperaturii și soluției asupra Φf și Φp au fost deja luate în considerare. Pe lângă randamentul cuantic,
sensibilitatea unei analize poate fi îmbunătățită folosind o sursă de excitație care are o intensitate mai
mare de emisie, P0, la lungimea de undă dorită și selectând o lungime de undă de excitație care are o
absorbanță mai mare. O altă abordare pentru îmbunătățirea sensibilității este creșterea volumului în
eșantionul din care este monitorizată emisia. Figura 10.56 arată cum rotirea fantei unui monocromator
de la orientarea lor obișnuită verticală la o orientare orizontală crește volumul de eșantionare.
Rezultatul poate crește emisia din eșantion cu 5-30 ×.

Figura 10.56 Utilizarea orientării fantei pentru a modifica volumul din care se măsoară fluorescența: (a)
orientarea verticală a fantei; (b) orientarea orizontală a fantei. Să presupunem că dimensiunile fantei
sunt 0,1 mm × 3 mm. În (a) dimensiunile volumului de eșantionare sunt 0,1 mm × 0,1 mm × 3 mm sau
0,03 mm3. Pentru (b) dimensiunile volumului de eșantionare sunt 0,1 mm × 3 mm × 3 mm sau 0,9 mm3,
o creștere de 30 de ori a volumului de eșantionare.

Selectivitatea

Selectivitatea fluorescenței și a fosforescenței este superioară celei a spectrofotometriei de absorbție

din două motive: în primul rând, nu orice compus care absoarbe radiații este fluorescent sau
fosforescent; și, în al doilea rând, selectivitatea dintre un analit și un interferenț este posibilă dacă există
o diferență în excitația lor sau în spectrele lor de emisie. Intensitatea totală a emisiilor este o sumă
liniară a celei din fiecare specie fluorescentă sau fosforescentă. Prin urmare, analiza unui eșantion care
conține n componente poate fi realizată prin măsurarea intensității totale de emisie la n lungimi de
undă.